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探究猪蓝耳病在实验室检测中,我们不常接触的那些领域

猪生殖与呼吸综合征(PRRS)是世界范围内一种严重危害养猪业的传染病临床症状表现为生产母猪的繁殖障碍以及各种阶段猪的呼吸症状。繁殖障碍表现为受孕率下降、妊娠后期流产、产死胎、木乃伊胎与弱仔。虽然PRRS病理上表现出间质性肺炎的变化,但猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染后引起的病理及组织学变化往往不太典型,而且容易与其它病原感染所引起的病理变化相混淆。因此PRRS的确诊有赖于实验室诊断。

通过实验室方法,可以将PRRSV感染与猪瘟病毒、伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、血球凝集性脑脊髓炎病毒、猪肠道病毒、猪流感病毒、猪巨细胞病毒、以及钩端螺旋体等病原感染区别开

1、PRRS诊断注意事项

PRRSV的分离或检测的成功率取决于样品处理是否正确。一般来说,用于病毒分离的样品应尽可能在发病的早期采取,最好在发病开始的7-10天内,急性发病期样品病毒含量较高,而后期采取的样品往往容易得出可疑甚至阴性的结果。用丁二病毒学检验的样品也需要足量的初始样品。无菌采取新鲜样品并立即送往实验室进行病毒分离。如果不能马上送到实验室,则可在4℃冷藏保存不超过2天,如果需要保存较长的时间的话,则应保存于-70℃,但不要长期置于-20℃,注意不要反复冻融,在样品运送过程中最好使用干冰。

通过检测猪群血清的阳转或者测定PRRSV特异抗体滴度的上升同样可以用于PRRSV感染的诊断。针对以往有过感染史或已经注射了疫苗的猪群,血清学结果的判定应该慎重。因为到目前为止,任何一种血清方法还无法区分血清学的阳性结果是由野毒感染还是由于疫苗免疫所引起。另外,血清学方法也无法确定猪群感染的时间,只有将血清学结果与流行病学如病例对照实验结合起来才能做出准确的判断。当对某个猪群进行调查诊断时,有必要将其它的方法如PCR或病毒分离与血清学结果综合起来,这样才能对生产实践中PRRS的传播特点有个清晰的了解。

2、检测PRRS病毒的方法

2.1 病毒分离

PRRSV仅能在两类细胞上复制,猪肺泡巨噬细胞(PAM)以及特定的非洲绿肾细胞系。然而,所有的PRRSV分离毒株不能同时在这两类细胞上复制。这就意味着在进行病毒分离时应该尽可能利用两类细胞,在分离欧洲型毒株时应尽可能用PAM。文献报道PRRSV可以从各种临床样品中分离到,包括血清、血浆、外周血单核细胞、骨髓、扁桃体、肺脏、淋巴结、胸腺、脾脏、心、脑、肝、睾丸、副睾、输精管、尿道球腺、阴茎组织、口咽拭子、鼻甲、鼻拭子、胎盘、唾液、尿液、粪便以及精液中。如果怀疑感染PRRSV,无哪个阶段的猪,肺脏深处积液以及血清都是病毒分离最理想的材料,PRRSV在血清中要比在组织中稳定。对于老龄猪,病毒血症可能是一过性的,这时组织中分离到病毒的可能性要大一些。送到实验室的材料,通常应包括新鲜采集的肺、扁桃体以及淋巴结。急性感染猪的血清、肺脏以及支气管肺泡灌洗液较为合适。而对于持续性感染猪,扃桃体、口咽拭子以及支气管肺泡灌洗液比血清和肺脏更合适。对于晚期流产以及早产猪,吸初乳前的弱仔样品比木乃伊胎、流产或死胎样品效果好。感染仔猪群中,弱仔病毒血症的可能性最大,但应注意高滴度的母源抗体可以干扰病毒分离。

2.2 病毒或抗原的检测方法

冰冻切片免疫荧光抗体试验(FA)以及免疫组化试验(IHC)可以检测组织中的PRRSV抗原。冰冻切片的直接免疫荧光抗试验成本较低并且快速。这两种方法的特异性很高,但相对来说敏感性不够。样本的质量对FA结果影响非常大,所以应该注意采集新鲜的组织,并低温保存。IHC可以检测甲醛同定的组织,比FA的敏感性要高,但更费时而且成本更高。通过组织病理学切片,结合IHC以及FA试验的结果可以对PRRSV感染做出准确的诊断。直接FA试验可以检测新鲜样品或冷冻样品,用于IHC的组织应在10%中性缓冲甲醛中同定,组织样品最好采集心、肾、肺、淋巴结、脾脏、胸腺以及扁桃体,PRRSV抗原在肾上腺、肠道、肝脏或偶尔在脑组织中也能够检测剑。

2.3 分子生物学方法

PCR方法直接检测临床样品中PRRSV的基因组RNA。由于省去了病毒分离的过程,PCR比病毒分离要省时得多,敏感性和特异性都非常高。目前针对PRRSV的PCR检测方法报道很多,其中主要是针对ORF7,ORF6或ORFlb。另外也有报道采用更为敏感的巢式PCR方法检测PRRSV。随着PCR技术的发.展,也陆续出现了荧光标记的PCR方法,如TaqManTM PCR或分子信标PCR方法用于临床样品中PRRSV的诊断。这些方法比常规PCR方法的特异性更高,但是成本更高。最初PCR用于PRRS诊断的主要检测对象是精液或粪便中的病毒,因为这两种样品采用常规方法诊断比较困难。但是,胎儿组织以及胸腔液也可采用PCR方法。临床样品可以检测肺脏以及血清。PCR方法在PRRS的诊断以及群体监测上可以发挥很大作用,比如用于后备种猪的筛选,持续性感染猪的诊断以及用丁:猪群的净化工作。需要注意的是,不。同的实验室,由于病料的新鲜程度、病料处理方法、实验室的设备条件以及操作人员的技术与经验存在差异,所得到的结果也有可能不同,PCR的结果需要综合其它方法。

3、检测血清抗体的方法

直接免疫荧光抗体(IFA)试验,血清中和(SVN)试验、免疫过氧化酶单层细胞试验(IPMA)以及酶联免疫吸附试验(ELISA)都可用于测定PRRSV的特异性抗体。IFA用于检测单个发病猪的特异性最高(99.5%),该方法比ELISA优点的是能测定血清抗体的滴度,根据稀释方法的不同,血清抗体滴度为16或20可判定为阳性。IFA检测感染后2-3个月内的特异抗体可信度较高。同样,IPMA比ELISA的敏感性更高,特异性也非常好,IPMA方法可以在PRRSV感染后7-15内能检测到抗体。与IPA类似,IPMA检测感染后2-3个月内的特异性抗体可信度较高。实验毒株与感染野毒株的相关性可能对IPMA试验的结果有影响。ELISA方法的敏感性和特异性也较高,ELISA通常包括通过样品与阳性对照的比值(S/P)判定结果的间接ELISA方法,通过直接光吸收OD值的间接ELISA方法以及阻断ELISA方法。与其它方法相比,商品化的ELISA试剂盒由于生产以及实验操作的标准化和程序化,因而结果的一致性相对较高。同时,ELISA方法检测可在较短时间内得到结果,很多国家都将其列为法定或标准的操作方法。例如IDEXX公司新的ELISA试剂盒(HerdChekR2XR)检测,在疫苗免疫后4-6周血清阳转达到高峰,峰值约为2.5-3.5S/P。SVA试验也非常特异,但比IFA及ELISA的敏感性要低。可能是由于PRRSV特异的中和抗体要住感.染后1-2个月才能检测到,一般来说滴度>4则判定为阳性。SVA试验通常用于科研工作中,在生产实践中采用血清中和试验太费时费力。与IFA及IPMA方法类似,实验结果往往受实验毒株和感染毒株相关性的影响。

4、血清学结果的分析

针对PRRSV的特异抗体通常不能在猪体内持续终身。在实验感染条件下,通过IgG—IFA、IPMA、ELISA、SVA方法可分别在感染后5-9、9-11、9-13、9-28天内检测到抗体。PRRSV特异IgM抗体在接种后5天可以检测到,并可持续21-28天。不同的方法所检测抗体峰值时间各不相同:IFA 30-50天、IPMA 35-50天、ELISA 30-50天、SVN 60-90天,随后抗体滴度逐渐下降。感染PRRSV后各种方法检测抗体的消失时间:IFA 4-5个月、ELISA 4-10个月以上、IPMA l1-12个月、SVN 12个月。接种弱毒疫苗后各种检测方法的结果与上述时间段相当。

对于血清学检测的结果进行分析时应当注意的是,如果从疑似PRRS的单个猪体采集的单份血样检测为阳性,我们并不能轻易做出诊断结论。血清学阳性的结果并不能确定PRRSV是否能引起临床发病。首先我们要考虑母源抗体的问题,有学者报道母源抗体可在出生后4天检测到,并可持续约3周。但也有报道母源抗体持4—10周,最长的报道有16周。由于IFA和ELISA抗体持续时间较短,因此在检测猪群的感染状况时,应当选择青年猪,对于猪场来说,从分娩到育成猪群中,PRRSV感染引起的血清阳转率通常在生长育成阶段最高。

某个时段PRRS血清学结果为阴性有以下几种可能性,首先可能未感染PRRSV,或者感染但还未产生抗体,或以前感染过但现在血清转阴,最后还有可能是检测方法的敏感性不够或操作误差引起。因此我们对于单份血清样品的判断应该慎重。我们进行血清学分析时应该有这样的观念,现有的血清学方法更适合于整个猪群的监测,而不是针对单个个体进行诊断。通过双份血清滴度改变以及临床及病理学变化才可以对PRRS做出初步诊断,而准确的诊断还应与病毒分离或抗原检测手段结合起来。还应注意现有的血清学方法并不能区分抗体是由于疫苗免疫还是野毒感染引起。对于假定阴性的猪场进行血清学诊断还应注意假阳性的问题.此时也可以结合RT-PCR方法或重复检测。

5、鉴别诊断

常规的血清学方法不能区分疫苗抗体和野毒抗体。但有些方法可以对毒株进行鉴别,如单抗可以区分美洲株和欧洲株,此外,单抗也可以区分商业化的弱毒疫苗株和野毒株。采用分子生物学方法如PCR、RFLP以及DNA序列测定可以对PRRS病毒分离株进行进一步的分析。PCR方法可以区分欧洲株与美洲株,但其临床应用意义并不大。RFLP只能初略对不同的分离毒株进行分类,由于RFLP带谱与病毒毒力以及抗原的相关性并无关联,而且由于RFLP仅代表部分病毒基因组序列,因此在临床上的意义也不显著。测序测定可以在分子水平上分析不同毒株间的相关性,直接了解核苷酸的插入、缺失或突变等变化,因而可以分析在一定时段内病毒在猪群间传播的背景。而且序列测定可以有助于区分疫苗毒株和野毒株,绘制不同猪群分离毒株的进化树。很多报道表明了PRRSV分离毒株间基因水平上的多样性,提示PRRSV在一定时段内快速进化。但是在实验条件下,继代的PRRSV与原毒株间序列的差异不到l%。相反,野毒分离株间序列的差异往往达到15%以上,因此如果两个毒株间的序列差异大于O.5-1%,则认为毒株间并无明显的亲缘关系。虽然序列测定是分析毒株间相关性的最好方法,但有些问题,比如毒株的来源、致病性、或生物学特性等疑问并不能通过序列测定得到合理的解释。因此如果分离株与疫苗株间有较大的相似性也不能根据序列结果来筛选疫苗毒株。

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